Количественный анализ различных закономерностей, применяемых в решетчатой ​​световой листовой микроскопии.

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4607 (2022) Цитировать эту статью

3472 Доступа

2 цитаты

25 Альтметрика

Подробности о метриках

Световые листовые микроскопы снижают фототоксичность и фон, а также улучшают скорость получения изображений по сравнению с широкопольными и конфокальными микроскопами. Однако при использовании гауссовских лучей осевая разрешающая способность светового листового микроскопа и наблюдаемое поле зрения обратно пропорциональны. Световые листы на основе размытых оптических решеток улучшают осевое разрешение и однородность луча по сравнению с гауссовскими лучами за счет использования аксиально структурированных диаграмм освещения. Однако эти преимущества достигаются за счет увеличения общей освещенности образца и уменьшения осевого ограничения диаграммы направленности освещения. Используя моделирование и экспериментальные измерения в фиксированных и живых клетках, мы количественно оценили различия между гауссовскими и решетчатыми световыми листами по однородности луча, осевому разрешению, латеральному разрешению и фотообесцвечиванию. Мы демонстрируем, как можно настроить различные схемы освещения оптической решетки, чтобы отдать приоритет либо осевому разрешению, либо оптическому сечению. Наконец, мы представляем подход к спектральному слиянию последовательных снимков различных структур решетчатых световых листов с дополняющими оптическими свойствами для достижения как высокого разрешения, так и изображений с низким фоном.

За последние два десятилетия световая листовая микроскопия использовалась для получения изображений биологических образцов различного масштаба, от отдельных молекул до целых организмов1,2,3,4. Световая листовая микроскопия освещает только тонкую плоскость образца. Это сводит к минимуму расфокусированное освещение, уменьшает фотообесцвечивание и увеличивает отношение сигнал/шум (SNR) по сравнению с эпифлуоресценцией и конфокальной микроскопией. Более того, во флуоресцентной микроскопии общая функция рассеяния точки (PSF) является продуктом PSF как возбуждения, так и обнаружения. Таким образом, если диаграмма направленности освещения сопоставима с глубиной резкости обнаружения или меньше ее, одноплоскостное освещение также может повысить осевое разрешение. Хотя методы точечного сканирования, такие как конфокальное, также увеличивают осевое разрешение и оптическое секционирование, плоское освещение с широкоугольным обнаружением обеспечивает в 100–1000 раз более высокую скорость получения изображений при значительно меньшем фотообесцвечивании5.

В наиболее распространенных реализациях световой листовой микроскопии используются цилиндрические линзы для фокусировки гауссова луча в вытянутый вбок лист с гауссовским осевым профилем интенсивности на образце. Этот подход приводит к неизбежному компромиссу между толщиной светового слоя и длиной его распространения. Более тонкие гауссовы световые листы обеспечивают большее осевое разрешение и оптическое сечение, но за счет более короткой длины распространения и меньшего поля зрения. Напротив, более толстые гауссовы световые листы могут отображать большие площади, но имеют более низкое разрешение и оптическое сечение. Чтобы преодолеть эти компромиссы, ряд групп предложили использовать для освещения структурированные световые листы, в том числе лучи Бесселя6,7, лучи Эйри8,9 и оптические решетки2,10, чтобы отделить осевое разрешение от длины распространения луча. На практике такие идеализированные недифрагирующие лучи потребуют бесконечной энергии и не могут быть физически реализованы. Вместо этого генерируются лучи, которые представляют собой гибрид гауссовых и недифрагирующих лучей (например, пучков Бесселя-Гаусса или решетки-Гаусса), в которых диаграмма освещения ограничена аксиально распределенной огибающей затухания, чтобы удержать энергию освещения вокруг одной плоскости при образец. Изменение ширины огибающей ослабления на образце или, что эквивалентно, расширение распределения интенсивности освещения в задней фокальной плоскости объектива возбуждения вдоль kz (который также является осевым направлением объектива обнаружения) позволяет пользователю настроить характер схемы освещения, чтобы отдать предпочтение длине распространения, осевому разрешению или оптическому срезу в зависимости от биологического образца и целей визуализации.